Comparación de dos métodos rápidos para la detección de Salmonella spp. con un método convencional

Resumen

Introducción. Uno de los microorganismos relacionados con las enfermedades transmitidas por alimentos a escala mundial es Salmonella spp. El control sanitario de este patógeno es una de las principales preocupaciones en salud pública. La detección de Salmonella spp. se realiza principalmente por métodos convencionales de cultivo y métodos rápidos automatizados; la diferencia entre ellos se centra en el tiempo de emisión de resultados. Los métodos automatizados son más rápido que los convencionales. Tener los resultados en menos tiempo es importante en salud pública. Objetivos. Comparar el desempeño de dos métodos rápidos para la detección de Salmonella spp.: el método de reacción de la cadena de la polimerasa Assurance GDS System y el inmuno-ensayo visual VIA TECRA con el método convencional para la detección de Salmonella spp. ISO 6579:2002, IDT, considerado de referencia internacional. Metodología. Se analizaron 96 muestras de carne fresca de pollo, proveniente de supermercados del área metropolitana de San Salvador. Las muestras fueron analizadas simultáneamente por los tres métodos en estudio. Se realizaron los cálculos de sensibilidad, especificidad, tasa de falsos positivos, tasa de falsos negativos y Chi cuadrado descrito por McNemar. Resultados. El método alternativo inmunoensayo obtuvo mejores resultados al compararlos con los del método convencional; se obtuvo un 88 % de exactitud relativa, 88 % de sensibilidad, 86 % de especificidad, 14 % de tasa de falsos positivos y un 12 % de tasa de falsos negativos. Mientras que al realizar la comparación con el método Assurance GDS System se obtuvo un 85 % de sensibilidad, 81 % de especificidad, 19 % de tasa de falsos positivos y un 15 % de tasa de falsos negativos. Al evaluar los datos discordantes y aplicar el test de Chi cuadrado se determinó que no existe diferencia significativa entre los métodos evaluados (P≤0,05). Conclusiones. El método alternativo inmunoensayo visual obtuvo los mejores resultados contra el método convencional.

Abstract

Introducción

Las enfermedades transmitidas por alimentos son un serio problema de salud pública. Una de cada diez personas enferman por ingerir alimentos insalubres¹. Garantizar la inocuidad de los alimentos requiere una serie de medidas sanitarias desde la fabricación hasta la mesa². La salud pública implementa estrategias como la vigilancia sanitaria de los alimentos en puntos de comercialización, con el fin de identificar microorganismos patógenos e implementar medidas sanitarias de prevención. Sin embargo, para realizar una adecuada vigilancia se requieren de herramientas, como pruebas de laboratorio, que garanticen una identificación oportuna de los microorganismos en estudio. Estos métodos de análisis deben estar acorde a las necesidades, haciendo un balance entre costo y tiempo de obtención de resultados. La confiabilidad de los resultados obtenidos dependerá de la técnica seleccionada para realizar el análisis (sensibilidad y especificidad)³.

El Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) es el encargado de realizar los análisis de laboratorio para el registro sanitario y vigilancia de los alimentos que se comercializan en El Salvador, cuenta con métodos convencionales y métodos rápidos para el análisis microbiológico de alimentos. Los métodos rápidos, como nuevas herramientas de respuesta en tiempos cortos, frente a la detección de patógenos de interés, utilizan la ciencia y tecnología para dar resultados oportunos. Estos métodos, además, se enfocan en identificar metabolitos, genes, reacciones específicas, entre otros, del microorganismo en estudio, por lo que los tiempos de espera se reducen en comparación con el método de cultivo convencional, cuyos orígenes se basan en el desarrollo de células viables que son evidenciadas por medio del crecimiento y reacciones bioquímicas específicas en sustratos específicos o medios de cultivo. Esto implica tiempos de espera más prolongados, pero con resultados indudablemente confiables⁴.

Uno los parámetros microbiológicos de importancia para salud pública es la determinación de Salmonella spp. en alimentos, microorganismo causante de la salmonelosis, enfermedad que afecta anualmente a millones de personas de todo el mundo y provoca más de cien mil defunciones anuales⁵. Por tanto, la detección oportuna de Salmonella spp. en alimentos permite tomar medidas para proteger la salud de la población⁶. Para su identificación, el Laboratorio Nacional de Referencia utiliza tres métodos de análisis: el Assurance GDS Salmonella (AOAC 2009.03), el inmunoensayo VIA TECRA Salmonella (AOAC 998.09) y el método convencional ISO 6579:2002 IDT. Los primeros dos son métodos rápidos y proporcionan los resultados en menor tiempo que el método convencional, el cual puede tardar entre cuatro a seis días para la detección. Un resultado rápido y oportuno puede evitar que personas enfermen por ingerir alimentos contaminados con este microorganismo patógeno involucrado en enfermedades transmitidas por alimentos⁷. A pesar de las múltiples ventajas de los métodos automatizados, es importante garantizar que estos sean efectivos y que cumplan todos los parámetros de calidad. Demostrar que los métodos rápidos son comparables a los métodos tradicionales y que cumplen con el fin previsto de análisis es una de las grandes oportunidades en la vigilancia sanitaria. El objetivo del presente estudio fue comparar dos métodos rápidos con el método convencional ISO 6579:2002 para la determinación de Salmonella spp. en carne de pollo.

Metodología

Se realizó un estudio descriptivo de corte transversal donde se compararon dos métodos rápidos para la determinación de Salmonella spp. en carne de pollo: el método molecular (Assurance GDS Salmonella) (AOAC 2009.03) y el inmunoensayo visual (VIA TECRA Salmonella) (AOAC 998.09). Estos se compararon con el método convencional para la detección de Salmonella spp. ISO 6579:2002 IDT. Se calculó la sensibilidad, la especificidad, la tasa de falsos positivos, la tasa de falsos negativos de cada uno, utilizando como referencia los parámetros establecidos en la ISO 16140:2003⁸.

Se buscaron diferencias significativas entre los métodos rápidos y el método convencional, realizando la prueba estadística de McNemar (una prueba de Chi cuadrado X ²), utilizando Microsoft Excel 2010. La prueba establece que la proporción de positivos confirmados por el método alternativo no debe ser estadísticamente diferente de la proporción de positivos confirmados por el método de referencia (convencional)⁹.

El universo estuvo compuesto por 302 muestras de carne de pollo que se colectaron en un estudio sobre la contaminación microbiológica de la carne de pollo en supermercados, realizado por el Instituto Nacional de Salud (INS) en el año 2015¹⁰. Se calculó una población muestral de 72 con un nivel de confianza del 95 % y un margen de error del 10 %. Se tuvo la disponibilidad de analizar 24 muestras extras, por lo que los resultados también se agregaron a la población muestral de 72. Se obtuvieron un total de 96 muestras de forma aleatoria, las cuales fueron analizadas y con las que se realizó la comparación de métodos en el presente estudio. Este se realizó en el periodo de mayo a noviembre de 2015.

Preparación de la muestra

A partir de cada una de las muestras se pesaron asépticamente 25 g de carne de pollo y se mezclaron con 225 mL de agua peptonada 1 % (AP 1 %), se homogenizaron en Stomacher y se incubaron a 35°C ± 2ºC de 18-24 horas. Este procedimiento de preparación es el mismo para todos los métodos correspondientes a este estudio. De esta etapa en adelante se trabajó en simultáneo cada muestra para el método convencional, el Assurance GDS y el inmunoensayo TECRA.

Método convencional, según ISO 6579:2002

En este método, el preenriquecimiento de la muestra en AP 1 % va seguido de un enriquecimiento selectivo en Caldo Rappaport (41,5ºC ± 1ºC/24 h ± 3 h) y caldo Tetrationato con novobiocina (37ºC ± 1ºC/24 h ± 3 h). Pasado el período de incubación se realiza el aislamiento en medio selectivo y diferencial, estriando un inóculo tomado a partir de los caldos selectivos, en Agar XLD, HE y BS, los cuales se incubaron durante (24 ± 2) h a (35 ± 2) °C. Se aislaron colonias con aspecto típico de Salmonella de cada uno de los medios selectivos utilizados y se inocularon cada colonia en Agar TSI, LIA y caldo urea, incubados por (24 ± 2) h a (35 ± 2) °C. Los resultados positivos a la prueba de TSI, LIA y urea se complementaron por medio de la realización de pruebas de identificación bioquímica comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante (API 20E)¹¹.

Método Screening Assurance GDS System

Una vez culminada la incubación de la etapa de preenriquecimiento, se tomó un mL de la muestra en AP 1 % y se colocó en los pocillos que contenían el reactivo de concentración, utilizando una pipeta multicanal (Pickpen). Se transfirió la muestra a través de la solución de lavado a los pocillos con BHI, se incubaron los pocillos por dos horas entre (35 y 37) °C. Pasado el lapso de incubación, con la pipeta multicanal se transfirieron las partículas contenidas en BHI a las placas con buffer de resuspensión. Luego se procedió a la amplificación y detección del microorganismo en estudio en el equipo automatizado Rotor Gene GDS. Si el resultado obtenido era negativo, el análisis finalizaba en esta etapa. Para las muestras positivas presuntivas, se continuaba el procedimiento a partir de la muestra en AP 1 % como lo indica el método convencional, para las fases de enriquecimiento en caldo, aislamiento e identificación, confirmación bioquímica¹².

Método screening Inmunoensayo visual VIA TECRA Salmonella

La muestra preenriquecida se transfirió a los caldos selectivos Rappaport (42ºC ± 0,2ºC/24 h ± 2 h) y Tetrationato (43ºC ± 0,2ºC/24 h ± 2 h). Se tomó un mL de cada cultivo y se transfirieron a dos tubos con caldo M, respectivamente. Se transfirieron 0,5 mL de cada uno de los enriquecimientos en caldo M (para un volumen de un mL en total) a un tubo con tapón de rosca para su calentamiento en agua hirviendo por (10-15) min. Se dejó enfriar a temperatura ambiente y se procedió a transferir 0,2 mL de cada una de las muestras hervidas previamente a los respectivos pocillos para posterior realización del inmunoensayo. Esto requirió de un primer lavado, adición del conjugado, segundo lavado, adición del substrato y, finalmente, se comprobó el color de los pocillos contra la carta del color propia del kit utilizado¹³.

Las muestras presuntivas positivas se confirmaron por estriado del cultivo proveniente de los caldos Rappaport, caldo tetrationato y caldo M, en agar HE, XLD y BS. Las colonias típicas o sospechosas obtenidas fueron confirmadas según el método convencional.

Resultados

El método convencional ISO 6579:2002 fue capaz de detectar al patógeno en estudio en 59 de las 96 muestras analizadas, lo que equivale a un 61 % de positividad. Respecto al método molecular, de las 96 muestras procesadas se obtuvo un porcentaje de positividad del 59 %. Es decir, 57 de 96 muestras proporcionaron un resultado positivo al patógeno en estudio; mientras que el 41 % restante, equivalente a 39 muestras, resultaron ser negativas a Salmonella spp. El inmunoensayo visual mostró un porcentaje de positividad del 59 %. Es decir, 57 de 96 muestras dieron resultado positivo al patógeno en estudio; mientras que el 41 % restante, equivalente a 39 muestras, resultaron ser negativas a Salmonella spp.

Comparación de los métodos en estudio

En la Tabla 1 se muestra el recuento general de cada uno de los elementos que permiten evaluar los métodos molecular e inmunoensayo visual, contra el método de cultivo convencional. Se observa que el método de inmunoensayo visual posee mayor cantidad de verdaderos positivos (52) y verdaderos negativos (32), y una menor cantidad de falsos negativos (7) y falsos positivos (5), contra lo correspondiente al Assurance GDS System. Respecto al método alternativo uno, método molecular, obtuvo un 85 % de sensibilidad. El inmunoensayo visual mostró una exactitud relativa del 88 % (un 5 % mayor que lo reportado por método molecular) y sensibilidad del 88 % (un 3 % más alta comparado con el molecular).

Los resultados referidos a la especificidad nos muestran al inmunoensayo visual con un 86 %, mientras que el molecular con un 81 %, teniendo, por tanto, un mejor desempeño el inmunoensayo. Se atribuye el 100 % al método convencional, siendo este la referencia. El método molecular posee una tasa de falsos positivos del 19 %, que supera al 14 % calculado para el inmunoensayo visual.

El test de significancia aplicando Chi cuadrado, descrito por McNemar, es una prueba que establece que la proporción de presuntivos confirmados por el método alternativo no es estadísticamente diferente a la proporción de positivos confirmados por el método de referencia para cada tipo de alimento. Por lo que los resultados planteados solo corresponden a carne fresca de pollo.

El resultado obtenido a través de este estudio aporta un valor de 0,0625, el cual es menor a 3,84, cumpliendo así con el parámetro planteado por McNemar. De esta manera se puede considerar que no existen diferencias significativas entre los métodos Assurance GDS System y el cultivo convencional, con un nivel de significancia del 5 %. El valor de Chi cuadrado descrito por McNemar para el inmunoensayo VIA TECRA fue de 0,083. Lo que implica que no existen diferencias significativas entre VIA TECRA Salmonella y el cultivo convencional, con un nivel de significancia del 5 %.

Discusión

La carne fresca de pollo es un reservorio comprobado del agente Salmonella spp., ya que fue posible su detección mediante los tres métodos: convencional, método molecular e inmunoensayo visual, en un 59 % de las muestras y en el cultivo convencional en un 61 %. Asimismo, se evidencia que la carne fresca de pollo constituye una matriz de alta complejidad, ya que posee una gran cantidad de flora acompañante e interferente para su aislamiento.

Como se planteó en los análisis de resultados, al evaluar la cantidad de muestras correctamente asignadas como positivas al patógeno en estudio, en el análisis presuntivo emitido por los métodos alternativos molecular e inmunoensayo, es este último el que resultó con un porcentaje mayor en la detección de Salmonella spp. en carne fresca de pollo. El método inmunoensayo visual obtuvo un 88 % de sensibilidad ante el microorganismo diana; mientras que el método molecular fue sensible en un 85 % de las muestras que mediante el método convencional confirmaron ser positivas para Salmonella spp.

Los resultados obtenidos según los parámetros evaluados muestran que la metodología molecular y el inmunoensayo visual ofrecen una alta sensibilidad y especificidad en la detección de Salmonella spp. en la matriz evaluada. El inmunoensayo visual contra el método molecular tiene de un 3 % más capacidad de detectar a Salmonella spp. en la carne fresca de pollo.

En el método molecular la tasa de falsos positivos nos permite estimar en qué medida el método nos provee una respuesta positiva en la etapa presuntiva, que resulta ser negativa al confirmar por métodos convencionales de cultivo. Hecho que afecta en razón de costos, ya que estos se ven aumentados al sugerir muestras con resultados presuntivos positivos que deben pasar a la etapa confirmativa. El porcentaje relativamente alto de falsos positivos también puede deberse a la elevada carga de la flora acompañante en las muestras.

La tasa de falsos negativos para el método molecular posee el valor más alto, correspondiente a este parámetro, obteniendo un 15 % de falsos negativos, contra un 12 % del inmunoensayo visual. Estos resultados activan una alerta debido a que existe una posibilidad de liberar muestras de alimentos (12 %-15 %) “presuntivamente negativas”, que al seguir el método convencional son “confirmadas positivas”. Esto genera que una proporción de las muestras que poseen al patógeno no sean detectadas mediante los métodos alternativos evaluados.

El método molecular muestra que los resultados obtenidos se encuentran muy cercanos a los determinados por el método convencional, tomado como de referencia. La capacidad que posee este método asignando correctamente una muestra positiva en el análisis presuntivo corresponde a un 85 %. Cabe destacar que los métodos de tipo molecular se ven afectados por diversas características propias de la matriz, como la presencia de inhibidores, grasa propia de la muestra, entre otros, lo que puede generar cierto nivel de interferencia al momento de realizar los análisis.

Respecto al test de significancia de McNemar, se demostró que no existe diferencia significativa entre los métodos Assurance GDS System y el inmunoensayo VIA TECRA contra el método horizontal para la detección de Salmonella spp. (ISO 6579:2002, IDT), evaluados con un nivel de significancia P≤0,05. Este criterio es aplicable específicamente para la matriz en estudio: carne fresca de pollo. Por lo que se determina que los métodos en estudio son comparables entre sí.

Romero et al., en su estudio comparativo, concluye que la técnica de PCR tiempo real (TR) obtuvo los mismos valores de sensibilidad y valor predictivo positivo que el método convencional ISO 6579. Lo que demuestra que la PCR-TR es una valiosa prueba alternativa en el tamizaje para la detección de Salmonella spp. en cárnicos, además de disminuir el tiempos de diagnóstico¹⁴.

Es importante enfatizar que la PCR, así como el inmunoensayo visual, complementa pero no reemplaza las técnicas microbiológicas tradicionales, debido a que los resultados positivos presuntivos deben confirmarse por el método convencional¹⁵.

Los métodos de cultivo mejorados que contiene sustratos específicos, así como los basados ​​en ácidos nucleicos e inmunoensayos, dominan el mercado de los métodos alternativos. Sin embargo, la validación por instituciones independientes, por ejemplo AOAC, AFNOR, MicroVal y NordVal, es un elemento clave para demostrar la aplicabilidad de un nuevo método y su equivalencia con los procedimientos estándar o convencionales¹⁶.

Conclusiones

La microflora presente en la carne fresca de pollo presenta un reto ante los métodos diagnósticos molecular e inmunoensayo visual por los falsos negativos. La capacidad de detección de Salmonella spp. con los métodos molecular e inmunoensayo visual es superior al 85 % de especificidad, clasificado dentro de un rango aceptable. Esto permite que dichos métodos se puedan usar como tamizaje y ser más costo-efectivos al disminuir el tiempo en la obtención de resultados y el consumo de reactivos. Dejando únicamente para el método convencional las muestras presuntivas positivas, es decir, sólo las confirmatorias.

El inmunoensayo visual contra el método molecular tiene una mayor capacidad para detectar a Salmonella spp. en la carne fresca de pollo. Los métodos evaluados inmunoensayo y método molecular no presentan diferencias significativas entre sí; sin embargo, no reemplazan los métodos convencionales.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Instituto Nacional de Salud y al Laboratorio Nacional de Referencia del Ministerio de Salud por su apreciable apoyo para la realización de los análisis microbiológicos respectivos.

Conflictos de interés

El equipo responsable del artículo expresa no tener ningún tipo de conflicto de intereses ni relación económica, personal, política, interés financiero ni académico que pueda influir en el juicio e interpretación del estudio. La fuente de financiamiento del estudio fueron fondos institucionales del Ministerio de Salud de El Salvador y fondos de la Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo (Aecid) en el marco del proyecto “Desarrollo y fortalecimiento institucional del Instituto Nacional de Salud de El Salvador”.

Referencias bibliográficas